漢回蒙古族人MBLExonⅠ52位基因頻率檢測及其意義
   趙鐵軍　韓　瑞　羅　強　賈天軍　張庶民
  　　甘露糖結(jié)合凝集素(mannanbindinglectin,MBL)是一種由肝臟合成和分泌的急性時相蛋白,可與甘露糖殘基結(jié)合,參與細(xì)胞表面識別,是天然免疫(innateim  munity)的重要組成部分,MBL基因多態(tài)性影響MBL水平,MBL的功能及基因結(jié)構(gòu)和感染性疾病的關(guān)系近年來倍受關(guān)注.具有變異型MBL的個體,其血清MBL水平低下,導(dǎo)致調(diào)理功能缺陷[1～3]。本研究采用已建立MBLEXONⅠ52位密碼子突變檢測的方法[4]測定健康漢族人及蒙族,回族人MBL基因Exon152位密碼子點突變的情況,為深入探索MBL基因突變引起調(diào)理吞噬缺損的機制和MBL分子的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系及MBL在臨床中的治療應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
    1　材料與方法
   1.1　主要試劑　TaqDNA聚合酶(1U/μl,MBI),10×
       Buffer(隨酶增送),dNTP(Promega),瓊脂糖(Sigma),紅細(xì)胞裂解液,DNA提取液,TE緩沖液,Tris-乙酸(TAE)電泳緩沖液,PCRMarker(DL2000,大連寶生物公司)。
   1.2　標(biāo)本的收集　漢族人來自張家口市中心血站,經(jīng)檢驗符合獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn),蒙族標(biāo)本來自內(nèi)蒙古自治區(qū)集寧市中旗旗醫(yī)院;回族標(biāo)本來自張家口地區(qū)中小學(xué)。均為健康人群;收集靜脈血標(biāo)本用EDTA-Na2抗凝(抗凝比例為10∶1),分離血漿,-86℃保存,供測定MBL含量,細(xì)胞成分用鹽酸胍法提取DNA。
   1.3　染色體DNA的提取　取抗凝血的細(xì)胞成分200μl,用紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞,離心5000r/min5min/次,棄上清,2次后,用生理鹽水平衡,離心12000r/min5min,去上清,采用胍鹽酸法提取DNA,根據(jù)剩余體積依次加入不同體積的的提取液(包括7.5mol/L胍 鹽酸、20mg/ml10%十二烷基磺酸鈉等),70℃水浴10min,振蕩混勻,再進(jìn)行15min,離心收集上清,乙醇沉淀DNA,TE溶解,-20℃保存,供PCR用。
 1.4　PCR-SSP檢測方法的應(yīng)用　用如下所述方法對所收集169例健康漢族人及58例蒙族人,100例回族人的Exon152位密碼子堿基突變進(jìn)行分析。
 1.4.1　由大連寶生物公司合成引物　codon52D引物1為:5′-CTGCACCCAGATTGTAGGACAGAG-3′,引物2為5′-TCTCCCTTGGTGCCATCACA-3′;codon52nonD引物1為5′-CTGCACCCAGATTGTAGGACAGAG-3′,引物3為5′-TCTCCCTTGGTGCCATCACG-3′;ControlHGH- 1s5′-TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3′,ControlHGH-′-CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3′。
 1.4.2　擴(kuò)增體系及參數(shù)設(shè)置如下　擴(kuò)增體系為25μl, 其中10×buffer(含有[NH4]2SO4)2.5μl,dNTP(2.5 mmol/L)2μl,primer1(10pmol/L)2.5μl,primer2(10 pmol/L)2.5μl或primer3(10pmol/L)2.5μl,Control HGH-1s和ControlHGH-2as分別為(10pmol/L)2.5μl TaqDNA酶2μl(1u/μl),Mg2+1.6mmol/L1.6μl,模板2 μl滅菌三蒸水補足總體積。預(yù)變性96℃1min,變性 96℃25s,70℃45s,延伸72℃45s(循環(huán)5次),變性 96℃25s,65℃50s,延伸72℃45s(循環(huán)21次),變性96℃25s,55℃60s,延伸72℃2min(循環(huán)4次)。
 1.5　擴(kuò)增產(chǎn)物分析　擴(kuò)增產(chǎn)物用TAE配制含0.5μg/ml溴化乙錠1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,電泳 4V/cm,30min;PCRMarker作為參照,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照,記錄。
 1.6　統(tǒng)計學(xué)方法　SPSS統(tǒng)計軟件行χ2檢驗。
 2　結(jié)果
    檢測169例健康漢族人52位密碼子的點突變情況,野生型為161例,占95.3%;突變雜合型為8例,占4.7%。突變純合子型(TGT/TGT)無。基因頻率分別為CGT為0.976;TGT為0.024。檢測58例蒙族人,野生型為58例,占100%?；蝾l率CGT為1,TGT為0。檢測100例回族人,野生型為100例,占100%?；蝾l率CGT為1,TGT為0。組間比較,χ2=7.667,P=0.022< 0.05;漢族與蒙族人比較,χ2=2.846,P=0.092> 0.05,漢族與回族人比較,χ2=4.879,P=0.027< 0.05。見表1。
 
    3　討論
    人類血清中MBL的水平主要由MBL編碼基因結(jié)構(gòu)決定,并受啟動子區(qū)域基因的活性調(diào)節(jié)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在ExonⅠ有3個突變位點,編碼區(qū)域上游突變會改變MBL的血清濃度,其中ExonⅠ的52位(Arg-Cys命名為等位基因D)、54位(Gly-Asp命名為等位基因B)和57位密碼子(Gly-Glu,等位基因C)突變會干擾MBL多肽進(jìn)一步組裝成功能性多聚體,進(jìn)而降低血清中功能性MBL的含量。而且研究發(fā)現(xiàn)其突變與許多疾病具有一定的相關(guān)性。在歐洲人群中,突變頻率最高的是在密碼子54位,Thomas等[5]報道在52位密碼子突變和慢性乙肝感染(其他基因沒突變)存在正相關(guān)(在歐洲人,而非亞洲人)。另一項日本研究學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)[6],52位密碼子突變與丙肝患者的疾病進(jìn)展呈正相關(guān)。本研究檢測3個民族人MBLExon152位基因突變的情況,以期為進(jìn)一步研究臨床相關(guān)疾病發(fā)生時MBL的基因突變情況奠定基礎(chǔ)。
    用PCR-SSP方法就北方地區(qū)收集的漢族健康人及蒙族,回族人的MBL基因ExonⅠ52位密碼子的點突變情況進(jìn)行調(diào)查、分析,169例漢族人野生型為161例,占95.3%;突變雜合型為8例,占4.7%。突變純合子型(TGT/TGT)無。基因頻率分別為CGT為0.976;TGT為0.024。58例蒙族人,野生型為58例,占100%?；蝾l率CGT為1,TGT為0。100例回族人,野生型為100例,占100%?；蝾l率CGT為1,TGT為0。本實驗研究顯示,ExonⅠ52位密碼子的點突變頻率不高,組間比較差異有顯著性;漢族與蒙族人差異沒有顯著性,漢族與回族人差異有顯著性。但由于本研究受地域、檢測例數(shù)所限,所得結(jié)果能否準(zhǔn)確反應(yīng)中國漢、蒙、回族人的MBL基因52位密碼子點突變頻率,還有待于擴(kuò)大標(biāo)本來源及檢測例數(shù),同時應(yīng)聯(lián)合檢測其他位點的突變情況,作更進(jìn)一步深入的研究。
參考文獻(xiàn)
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4　趙鐵軍,賈天軍,程建君.檢測MBLEXONⅠ52位密碼子點突變PCR-SSP方法的建立.國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊,2004,25,5:3965　ThomasHC,FosterGR,SumiyaM,etal.Mutationofgeneformannose-bindingproteinassociatedwithchronichepatitisBvirusinfection.Lancet,1996,348:1417
6　SasakiK,TsutsumiA,WakamuyaN,etal.Mannose-bindinglectin                          polymorphismsinpatientswithhepatitisCvirusinfection.ScandJGas troenterol,2000,35:960
本文摘自《廣州醫(yī)學(xué)》2005.05，建議納入回族研究。